Produire une DNA Taq Polymerase

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Introduction :

(For English version, just read the links below and make your favorite polymerase, easy :) )

La Taq Polymérase est une enzyme fréquemment utilisée pour faire des PCR et amplifier de l'ADN. Cette enzyme est utilisée dans tous les laboratoires de biologie moléculaire au monde. Elle sert, par exemple, au test PCR dans la détection de la COVID-19 (ce qui a engendré une crainte de voir une pénurie de réactifs et d'enzyme).

Depuis quelques années, le brevet de cette enzyme est tombé et il est possible de la produire assez facilement, ce qui permet d'économiser plusieurs centaines (milliers) d'euros. 

Protocole :

Voici le protocole simplifié de Protzko 2012 pour récupérer l'enzyme (à tester): 

  1. Inoculer 30 mL de milieu Luria contenant 100 ng/mL d'ampicilline avec 1 mL de culture saturée de la souche E. coli contenant le plasmide Taq ADN polymérase I. 
  2. Faire pousser la culture à 37°C en l'agitant à 200 rpm jusqu'à ce qu'elle devienne trouble (A6oo= 0,4-1,0). 
  3. Induire l'expression du gène de l'ADN Taq polymérase I en ajoutant de l'IPTG à 0,2 mM.
  4. Faire pousser la culture pendant 10 à 16 heures supplémentaires. 
  5. Distribuer 1 ml de culture bactérienne induite dans un tube microfuge. 
  6. Concentrer les cellules en les faisant tourner pendant 1 minute à la vitesse maximale à l'aide d'une microcentrifugeuse. 
  7. Décanter le surnageant du milieu et remettre le culot de bactéries en suspension avec 200 nL de tampon TEN. 
  8. Chauffer les cellules remises en suspension à 75°C pendant 30 minutes, en mélangeant brièvement toutes les 10 minutes. 
  9. Centrifuger pendant 10 minutes à la vitesse maximale dans une centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. 
  10. Transférer le surnageant contenant l'ADN Taq polymérase I recombinante dans un nouveau tube.

Voici quelques références intéressantes avec le protocole pour produire soi-même de la Taq Polymérase.

Références : 

(Follow the papers :) Enjoy! )

Voici quelques références intéressantes avec le protocole pour produire soi-même de la Taq Polymérase.

  1. Making Taq DNA polymerase in the undergraduate biology laboratory. P. Ferralli et al. BIOS, 78(2):69-74 (2007). https://doi.org/10.1893/0005-3155(2007)78[69:MTDPIT]2.0.CO;2 (http://faculty.salisbury.edu) 
  2. Taq Polymerase preparation. Robertson Lab, Perelman School of Medecine. www.med.upenn.edu/robertsonlab/taq-polymerase-preparation.html.
  3. Data of expression and purification of recombinant Taq DNA polymerase. N. Fang et al. Volume 9, 2016, Pages 81-84, ISSN 2352-3409.
  4. A scaled-down and simplified protocol for purifying recombinant Taq DNA polymerase. R. J. Protzko et al. Bios, Vol. 83, No. 1 (March 2012), pp. 8-11 (4 pages)
  5. Purification and characterization of Taq polymerase: A 9-week biochemistry laboratory project for undergraduate students. Bellin RM et al. Biochem Mol Biol Educ. 2010 Jan;38(1):11-6. doi: 10.1002/bmb.20352. PMID: 21567784. 
  6. Optimization of Taq DNA polymerase enzyme expression in Escherichia coli. Moazen F et al. Adv Biomed Res. 2012;1:82. doi: 10.4103/2277-9175.103004. Epub 2012 Oct 31. PMID: 23326812; PMCID: PMC3544109.

(Just make a mutant? A super polymerase!) Et pour faire une polymérase encore plus performante :

  1. A Single Amino Acid Change to Taq DNA Polymerase Enables Faster PCR, Reverse Transcription and Strand-Displacement. Barnes WM, Zhang Z, Kermekchiev MB..Front Bioeng Biotechnol. 2021 Jan 14;8:553474. 
  2. Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation ability as a useful reagent for genetic engineering. Yamagami T. et al. Front Microbiol. 2014 Sep 3;5:461. 

(Need the plasmid to express it?) Liens pour commander le plasmide avec le gène taq:

  1. pOPEN taq de Drew Endy sur Addgene.
  2. pAKTaq original de Engelke sur Addgene
  3. Une série d'enzymes gratuites du projet FreeGenes de Standford

 

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