Les technologies actuelles de clonage basées sur la recombinaison spécifique de site sont efficaces, simples à utiliser et flexibles, mais ont l'inconvénient de laisser des séquences de site de recombinaison dans la construction finale, ajoutant 8 à 13 acides aminés supplémentaires à la protéine exprimée.
Dans cet article, Engler et ses collègues ont conçu une stratégie de sous-clonage simple et rapide pour transférer tout fragment d'ADN d'intérêt d'un clone d'entrée dans un vecteur d'expression, sans ce défaut.
La stratégie est basée sur l'utilisation d'enzymes de restriction de type IIs, qui coupent en dehors de leur séquence de reconnaissance. Avec une conception appropriée des sites de clivage, deux fragments coupés par des enzymes de restriction de type IIs peuvent être ligaturés dans un produit dépourvu du site de restriction original.
Sur la base de cette propriété, une stratégie de clonage appelée clonage "Golden Gate" a été mise au point. Elle permet d'obtenir en un seul tube et en une seule étape des plasmides recombinants corrects à près de 100 % après seulement 5 minutes de ligature de restriction. Cette méthode est donc aussi efficace que les technologies de clonage par recombinaison actuellement utilisées, mais permet d'obtenir des plasmides recombinants qui ne contiennent pas de séquences indésirables dans la construction finale, ce qui apporte de la précision à ce processus fondamental de manipulation génétique.
Référence :
A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability
Carola Engler, Romy Kandzia, Sylvestre Marillonnet. PLOS. Published: November 5, 2008. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
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